Microscoop en resolutie.

[butterfly]

Hallo forum.
Dit is mijn eerste post. Ik ben zeer recent begonnen met microscopie en ben in een stadium waarin alles vragen oproept. Ik wil objecten gaan fotograferen en filmen. Heb een fantastische hobby in de zomer: http://www.farmlator.hu/html/movingleps.htm
Maar zoek ook iets in de winter. Vandaar mijn verdieping in dit zeer intrigerende vakgebied.

Mijn eerste vraag:

Is het vermogen van een microskoop om details te laten zien uit te drukken in pixels? Ik kan me bijvoorbeeld voorstellen dat iemand veel ervaring heeft met digitale fotografie (door een bepaalde microskoop) en door uitproberen ongeveer kan aangeven waar een toename van de resolutie geen extra details meer oplevert. Dit zal voor een belangrijk deel afhankelijk zijn van het glas dat door de microscoop wordt gebruikt. Ik ben met name geinteresseerd in dergelijke informatie mbt tot de Olympus AH2 vanox met eerste klas lenzen!

Hartelijk dank,
Rob

[D80]

Re: Microscoop en resolutie.

Kwaliteit microscoop wordt bepaald door (onder)scheidend vermogen, los van de hele behuizing en de gebruikte materialen, niet van de mogelijkheid sterk te vergroten.
Om een goed beeld te krijgen ga je moeten leren spelen met het diafragma (ja, ook microscopen hebben dat..., sommige zelfs twee!) van de condensor.
Hoe de kwaliteit uiteindelijk wordt uitgedrukt weet ik niet. Je gaat wel een microscoop moeten aanschaffen met veel instelmogelijkheden als je serieus wil werken.
De Olympus waar je van spreekt, is die niet speciaal gemaakt om foto's te nemen?

Pixels zijn enkel van toepassing op digitaal stuff.
Fotograferen van micropreparaten is ook voor mij een toekomstdoel...

[mutse]

Re: Microscoop en resolutie.

Het onderscheident vermogen is de mogelijkheid om 2 punten uit elkaar te houden. De beste resolutie die je kan berijken is je golflengte delen door 2 , dus ook de kleur van je licht speelt een rol , daarom dat de nieuwere microscopen een blauwfilter hebben omdat blauw de kleinste golflengte heeft en daardoor de beste resolutie. Maar dit alles hangt natuurlijk af van hoe goed je glaswerk is natuurlijk.

[erikdk]

Re: Microscoop en resolutie.

mijn impressies van microscopen dateren van lang geleden (practicum dierkunde en later weefselleer). Ik herinner me dat het scheidend vermogen onder andere afhankelijk was van de vergroting, en dat het zeker beroerd was op 1000 maal (daar had je dan ook een immersieobjectief: je moest doorheen een druppel olie scherpstellen). Voor wat het waard is: je kan eens gaan kijken naar wat in medische tijdschriften gepubliceerd wordt aan microscopie-foto's (voorbeelden: http://gut.bmj.com/cgi/content-nw/full/55/1/54/F3, http://gut.bmj.com/content/vol55/iss...t65318.f3.jpeg, http://gut.bmj.com/content/vol55/iss...t84475.f3.jpeg, http://gut.bmj.com/content/vol55/iss...t84475.f4.jpeg)

[KoRi]

Re: Microscoop en resolutie.

Kijk eens op de site www.krebsmicro.com. Veel schitterende microphotography beelden -zijn palmares is werkelijk indrukwekkend- en verder goed uitgewerkte artikels over de technische kant van de zaak. Denk dat je zeker zal vinden wat je zoekt.

Mvg, KoRi.
--

[mutse]

Re: Microscoop en resolutie.

woops vergeten, natuurlijk is de vergroting ook belangrijk

Maar door die maximale resolutie gaat de vergroting niet verder dan 1000x , meer zou onozel zijn want dan vergroot je zonder dat je meer ziet.

ps: vele foto's die je ziet op voorgaande website , zijn niet door een microscoop genomen, maar door een binoculair.

[butterfly]

Re: Microscoop en resolutie.

Het onderscheident vermogen is de mogelijkheid om 2 punten uit elkaar te houden. De beste resolutie die je kan berijken is je golflengte delen door 2 , dus ook de kleur van je licht speelt een rol , daarom dat de nieuwere microscopen een blauwfilter hebben omdat blauw de kleinste golflengte heeft en daardoor de beste resolutie. Maar dit alles hangt natuurlijk af van hoe goed je glaswerk is natuurlijk.

OK, bedankt voor je info, maar kun je dat ook vertalen naar de praktijk van pixelresolutie?
De golflengte delen door 2. Laten we zeggen 500 nm/2 = 250 nm. Wat is dit? Onderscheidend vermogen? Bij een kleinere afstand kan geen onderscheid worden getoond tussen punten of objecten? MAAR hoe verhoudt zich dat (theoretisch gezien) tot een ccd of cmos sensor van een digitaal foto apparaat of camcorder. Hoe druk je dat uit in pixels?
Groetjes,
Rob

[KoRi]

Re: Microscoop en resolutie.

Gewoon de golflengte van het licht delen door 2 om het oplossend of scheidend vermogen van een microscoop te bepalen is wel iets te optimistisch denk ik.

In de praktijk dient men ook rekening te houden met de kwaliteit van de optische elementen. Deze wordt aangegeven in de vorm van de numerieke apertuur (NA) die ook steeds op de objectieven is aangegeven. Typische waarden voor de NA van objectieven zijn bijvoorbeeld:

4x -> NA 0,1
10x -> NA 0,25
40x -> NA 0,65
100x -> NA 1,25 (olie immersie)

Hier een rekenvoorbeeldje:

het oplossend vermogen, i.e. de kleinst afstand waarop twee punten als dusdanig te onderscheiden zijn, wordt gegeven door:

r = 0,61 * (golflengte licht) / NA

Voor licht met een golflengte van bvb. 550 nm en een objectief van 10x met een NA van 0,25 geeft dit:

r = 0,61 * 550*10e-9 / 0,25 = 1,342*10e-6 m

De minimaal te onderscheiden afstand, ter hoogte van het object, bedraagt dus 1,342µm.

Door nu deze afstand te vermenigvuldigen met de optische vergroting van object naar sensorvlak (= vergroting objectief x eventuele vergroting van koppel-optiek) bekomen we de overeenkomstige afstand op de sensor.
In ons voorbeeld met een vergroting door het objectief van 10x en bijvoorbeeld een bijkomende vergroting van 2,5x door de koppeloptiek bekomen we aldus:

r op sensor = 1,342*10e-6 * 10 * 2,5 = 33,55*10e-6 m

De minimaal te onderscheiden afstand, ter hoogte van de sensor, bedraagt dus 33,55µm.

Om alle informatie in dit beeld te kunnen vastleggen mogen de pixels van de sensor niet groter zijn dan de helft van deze waarde. Voor de maximale pixelgrootte hebben we dus in ons voorbeeld:

33,55*10e-6 / 2 = 16,775*10e-6 m

Wanneer de pixels van de sensor dus kleiner of gelijk aan 16,775µm zijn leg je alle beschikbare info vast. Meer pixels levert enkel 'lege' vergrotingen op en dus geen extra details.
De grootte van de pixels van de sensor kan kan men natuurlijk makkelijk berekenen door de sensor breedte of lengte te delen door het totaal aantal pixels in horizontale of verticale richting.

Oh ja, nog even vermelden dat als het echt precies moet zijn, er moet rekening mee worden gehouden dat:
- Indien de NA van de condensor kleiner is dan die van het objectief in de berekeningen voor de NA het gemiddelde van de NA van de condensor en de NA van het objectief moet worden gebruikt.
- omwille van het feit dat de meeste sensoren gebruik maken van een Bayer-patroon het niet helemaal correct is te veronderstellen dat de pixelgrootte gelijk is aan de sensormaat gedeeld door het aantal pixels. De 'effectieve' pixels zijn dan als het ware iets groter dan de berekening laat uitschijnen omdat niet ieder pixel elke kleur vastlegt.


Tot zover ... KoRi.
--

[butterfly]

Re: Microscoop en resolutie.

Gewoon de golflengte van het licht delen door 2 om het oplossend of scheidend vermogen van een microscoop te bepalen is wel iets te optimistisch denk ik.

In de praktijk dient men ook rekening te houden met de kwaliteit van de optische elementen. Deze wordt aangegeven in de vorm van de numerieke apertuur (NA) die ook steeds op de objectieven is aangegeven. Typische waarden voor de NA van objectieven zijn bijvoorbeeld:

4x -> NA 0,1
10x -> NA 0,25
40x -> NA 0,65
100x -> NA 1,25 (olie immersie)

Hier een rekenvoorbeeldje:

het oplossend vermogen, i.e. de kleinst afstand waarop twee punten als dusdanig te onderscheiden zijn, wordt gegeven door:

r = 0,61 * (golflengte licht) / NA

Voor licht met een golflengte van bvb. 550 nm en een objectief van 10x met een NA van 0,25 geeft dit:

r = 0,61 * 550*10e-9 / 0,25 = 1,342*10e-6 m

De minimaal te onderscheiden afstand, ter hoogte van het object, bedraagt dus 1,342µm.

Door nu deze afstand te vermenigvuldigen met de optische vergroting van object naar sensorvlak (= vergroting objectief x eventuele vergroting van koppel-optiek) bekomen we de overeenkomstige afstand op de sensor.
In ons voorbeeld met een vergroting door het objectief van 10x en bijvoorbeeld een bijkomende vergroting van 2,5x door de koppeloptiek bekomen we aldus:

r op sensor = 1,342*10e-6 * 10 * 2,5 = 33,55*10e-6 m

De minimaal te onderscheiden afstand, ter hoogte van de sensor, bedraagt dus 33,55µm.

Om alle informatie in dit beeld te kunnen vastleggen mogen de pixels van de sensor niet groter zijn dan de helft van deze waarde. Voor de maximale pixelgrootte hebben we dus in ons voorbeeld:

33,55*10e-6 / 2 = 16,775*10e-6 m

Wanneer de pixels van de sensor dus kleiner of gelijk aan 16,775µm zijn leg je alle beschikbare info vast. Meer pixels levert enkel 'lege' vergrotingen op en dus geen extra details.
De grootte van de pixels van de sensor kan kan men natuurlijk makkelijk berekenen door de sensor breedte of lengte te delen door het totaal aantal pixels in horizontale of verticale richting.

Oh ja, nog even vermelden dat als het echt precies moet zijn, er moet rekening mee worden gehouden dat:
- Indien de NA van de condensor kleiner is dan die van het objectief in de berekeningen voor de NA het gemiddelde van de NA van de condensor en de NA van het objectief moet worden gebruikt.
- omwille van het feit dat de meeste sensoren gebruik maken van een Bayer-patroon het niet helemaal correct is te veronderstellen dat de pixelgrootte gelijk is aan de sensormaat gedeeld door het aantal pixels. De 'effectieve' pixels zijn dan als het ware iets groter dan de berekening laat uitschijnen omdat niet ieder pixel elke kleur vastlegt.


Tot zover ... KoRi.
--

Dit is erg zinvolle informatie. Bedankt daarvoor.
Misschien wil je nog even verder met me meedenken.
Wat ik probeer uit te zoeken is of ik door een microscopp met HDV (High Definition Video) meer details kan vastleggen dan met SDV (Standaard Definition Video). Tevens hoeveel pixels je (fotocamera) theoretisch nodig heeft om microskopische detaillering vast te leggen.

In mijn berekeningen gaat het me voorlopig even om orde van grootte. Preciezering komt later wel.
De sensor van bijvoorbeeld een Canon HV20 camcorder is 1/2.7 inch. Dit zou uitgedrukt in mm 0.94 mm zijn. Ik ga er van uit dat dit de diagonaal is. Rekening houdende met breedbeeld formaat (16:9) geldt voor de breedte van de sensor ca 8 mm. Per pixel is dus ca 8000/1920 = 4.16 micrometer gereserveerd. Op een apparaat dat opneemt in SDV is een pixel (op de sensor) ca 11.36 micrometer groot.

Volgens jouw voorgestelde rekenmethodes heb je om de door de microskoop getoonde detaillering te kunnen vastleggen pixels nodig van resp. 16.775, 16.775, 25.808, 33.55 (in jouw 4 voorbeelden) micrometer of kleiner. Dit loopt nog op naarmate de vergrotingen toenemen. In deze gevallen zou HDV niets toevoegen aan SDV, omdat in beide gevallen de pixels kleiner zijn dan de afstand waarop twee punten nog als twee punten te onderscheiden zijn.

Voor fotografie zou hetzelfde moeten gelden. Daar zijn de sensors groter, zeg 20000 micrometer. Je zou dan in theorie met een simpele 0,5 Megapixel (resoluitie ca 800 * 600) camera (mits goed glas) dezelfde kwaliteit afleveren als met 8, 10 of zelfs 12 miljoen pixels. Want 20000/800= 25 micrometer. Daarmee blijf je onder de meeste r-waarden.
Graag je commentaar. Kun je het eens zijn met bovenstaande stellingen? Zie ik iets over het hoofd?

Groetjes,
Rob

[Guest41]

Re: Microscoop en resolutie.

ik zie niet direct in waarom men scheidend/oplossend vermogen van de optica van de microscoop zou moeten matchen, op een pixel voor pixel basis, aan de beschikbare pixels op een sensor .. en als het vastleggen van het fenomeen nog gaat via een stuk optisch glas" dat camera gebonden is (ik zeg met opzet niet" lens") dan speelt het scheidend vermogen van dit glas ook nog eens mee .. maar misschien heb ik het verkeerd voor ..

[KoRi]

Re: Microscoop en resolutie.

De redenering klopt wel als je inderdaad uitgaat van die 2,5x vergroting tussen objectief en sensor. Echter als je 2,5x gebruikt met een sensor met een diagonaal van 9,4mm betekent dit dat slechts de een klein deel van het intermediair beeld (diameter typisch 18 of 20 mm, soms meer) wordt vastgelegd. Namelijk:

9,4mm / 2,5 = 3,76mm

Je legt dus slechts een klein deel van wat je ziet door je occulair vast. Om een groter deel vast te leggen moet de vergroting kleiner worden bvb. 0,66x. Dit geeft dan een afbeelding van een gebied met een diameter van:

9,4mm / 0,66 = 14,25mm

Wat wellicht meer in de buurt komt van wat je wil bekomen.

Als we nu met vergroting 0,66x terug de eerdere berekening voor maximale pixelgrootte uitvoeren voor laat ons zeggen het 10x objectief met NA 0,25, dan bokomen we 4,4µm.
Vergelijken met de pixelgroottes die je noemt voor SDV en HDV laat zien dat HDV dus wel degelijk beter is ten opzichte van SDV.

Nog even voor bvb een DSLR. Voor een sensor van 24mmx16mm hebben we om ongeveer hetzelfde in beeld te krijgen als hierboven tussen objectief en sensor een vergroting van ongeveer 2x nodig. Voor ons objectief van 10x NA 0,25 zou geeft dit een maximale pixelgrootte van 13,4µm. Oftewel een minimum aantal pixels van 24mm/13,4µm = 1791 bij 16mm/13,4µm = 1194.

[KoRi]

Re: Microscoop en resolutie.

ik zie niet direct in waarom men scheidend/oplossend vermogen van de optica van de microscoop zou moeten matchen, op een pixel voor pixel basis, aan de beschikbare pixels op een sensor .. en als het vastleggen van het fenomeen nog gaat via een stuk optisch glas" dat camera gebonden is (ik zeg met opzet niet" lens") dan speelt het scheidend vermogen van dit glas ook nog eens mee .. maar misschien heb ik het verkeerd voor ..

Ik begrijp wel wat je bedoeld. Voor zover ik weet redeneert men toch steeds op deze manier.
Men gaat er steeds van uit dat het scheidend vermogen van een microscoop volledig wordt bepaald door het objectief. Alle bijkomende vergrotingen, bijvoorbeeld door de occulairen, leveren geen extra details meer op ... Wat niet in het beeld van het objectief zit kan ook niet meer tevoorschijn komen door extra vergrotingen.
Wellicht wordt er stilzwijgend aangenomen dat een camera met een bepaald aantal pixels ook voorzien is van optica die van voldoende kwaliteit is om alle pixels 'op te lossen' (?).

Ben hier zeker geen specialist in hoor. Toevallig ben ik een tijdje geleden zelf bezig geweest met uitzoeken wat er zoal bij kwam kijken om aan fotomicrografie te doen (*). Echter veel verder dan de theorie is het tot hiertoe nog niet gekomen . Dus als iemand er meer over weet hoor ik het ook graag.

(*) Waarbij ik toevallig de al eerder genoemde zeer interessante site www.krebsmicro.com heb ontdekt.

Mvg, KoRi.
--

[butterfly]

Re: Microscoop en resolutie.

De redenering klopt wel als je inderdaad uitgaat van die 2,5x vergroting tussen objectief en sensor. Echter als je 2,5x gebruikt met een sensor met een diagonaal van 9,4mm betekent dit dat slechts de een klein deel van het intermediair beeld (diameter typisch 18 of 20 mm, soms meer) wordt vastgelegd. Namelijk:

9,4mm / 2,5 = 3,76mm

Je legt dus slechts een klein deel van wat je ziet door je occulair vast. Om een groter deel vast te leggen moet de vergroting kleiner worden bvb. 0,66x. Dit geeft dan een afbeelding van een gebied met een diameter van:

9,4mm / 0,66 = 14,25mm

Wat wellicht meer in de buurt komt van wat je wil bekomen.

Als we nu met vergroting 0,66x terug de eerdere berekening voor maximale pixelgrootte uitvoeren voor laat ons zeggen het 10x objectief met NA 0,25, dan bokomen we 4,4µm.
Vergelijken met de pixelgroottes die je noemt voor SDV en HDV laat zien dat HDV dus wel degelijk beter is ten opzichte van SDV.

Nog even voor bvb een DSLR. Voor een sensor van 24mmx16mm hebben we om ongeveer hetzelfde in beeld te krijgen als hierboven tussen objectief en sensor een vergroting van ongeveer 2x nodig. Voor ons objectief van 10x NA 0,25 zou geeft dit een maximale pixelgrootte van 13,4µm. Oftewel een minimum aantal pixels van 24mm/13,4µm = 1791 bij 16mm/13,4µm = 1194.

OK, dat brengt een ander licht op HD, hoewel ik toch vooral zal welken op vergrotingen vanaf 100*.

Ik begrijp niet waarom je 9.4 door de vergoting deelt (dan wel door 2.5 of door 0.66) om uit te rekenen welk deel van het intermediair beeld wordt vastgelegd. Kun je dat ook anders uitleggen. Als het intermediair beeld ca 20 mm groot is waarom moet je dan uberhaupt nog vergroten. Dit zal wel basisstof zijn voor een microscopist, maar ik heb deze basis nog niet. Hopelijk kun je het uileggen.

[erikdk]

Re: Microscoop en resolutie.

vergeet bij jullie berekeningen niet dat je om een analoog beeld te digitaliseren zonder verlies, je 2 (of 4???) pixels nodig hebt per punt (ik ben vergeten naar wie de wet is genoemd, kan dat de wet van Bell zijn? het is een fundamenteel theorema van de informatietheorie, maar dat is zowat 30 jaar geleden voor mij). Voor muziek is de nodige samplingfrequentie dubbel de hoogste toon (vandaar de 44kHz van de CDs), maar ik veronderstel dat voor een foto in 2 dimensies je 2 x 2 = 4 pixels nodig hebt per punt.

[KoRi]

Re: Microscoop en resolutie.

vergeet bij jullie berekeningen niet dat je om een analoog beeld te digitaliseren zonder verlies, je 2 (of 4???) pixels nodig hebt per punt (ik ben vergeten naar wie de wet is genoemd, kan dat de wet van Bell zijn? het is een fundamenteel theorema van de informatietheorie, maar dat is zowat 30 jaar geleden voor mij). Voor muziek is de nodige samplingfrequentie dubbel de hoogste toon (vandaar de 44kHz van de CDs), maar ik veronderstel dat voor een foto in 2 dimensies je 2 x 2 = 4 pixels nodig hebt per punt.

Is rekening mee gehouden. 't Is daarom dat we in de berekening de maximale pixelgrootte ook hebben gedeeld door 2:

Om alle informatie in dit beeld te kunnen vastleggen mogen de pixels van de sensor niet groter zijn dan de helft van deze waarde.

Is dat niet het Nyquest-theorema?

@butterfly:
De deling door bvb. 2,5 van de sensordiagonaal is om te weten te komen hoe groot de overeenkomstige diagonaal is van het stuk intermediair beeld - dus het stuk dat wordt vastgelegd. Immers:

diagonaal in intermediar beeld x 2,5 = diagonaal sensor

Of:

diagonaal in intermediar beeld = diagonaal sensor / 2,5

Als het intermediair beeld ca 20 mm groot is waarom moet je dan uberhaupt nog vergroten?

Is, denk ik, in principe inderdaad niet echt noodzakelijk. Wanneer je ervoor kan zorgen dat de sensor samenvalt met het intermediair beeld kan het ook rechtstreeks worden vastgelegd - al betwijfel ik of dat met alle microscopen kan. De extra vergroting, of verkleining - want dat is eigenlijk die 0,66x - dient om de grootte van de sensor beter laten overeen te komen met de grootte van het intermediair beeld. Zonder bijkomende aanpassing, dus met een bijkomende vergroting van 1x, legt een sensor van 9mm uiteraard 9mm vast van de ca. 20mm. Om een groter deel vast te leggen heb je dus, in dit geval, een verkleining nodig.